文献名：Comparing Data-Independent Acquisition and Parallel Reaction Monitoring in Their Abilities To Differentiate High-Density Lipoprotein Subclasses（比较DIA和PRM区分高密度脂蛋白亚类的能力）
期刊名：Journal of Proteome Research
发表时间：2019年11月
IF：3.78
单位：
- 圣保罗大学
- Universidade Nove de Julho
样本：人血浆
技术：DIA和PRM
一、 概述：（用精炼的语言描述文章的整体思路及结果）
高密度脂蛋白（High-density lipoprotein，HDL）是一组具有多种心脏保护功能的复杂脂蛋白。由于其复杂性，对HDL中亚类成员的定量是一个挑战。本文比较了蛋白质组学中DIA和PRM技术在区分HDL亚类蛋白质的能力。所得结果显示DIA和PRM在定量的线形、准确度和精密度方面具有可比性，均展现了较好的效果。通过这2种蛋白质组定量的方式，精确量化不同HDL亚类中的蛋白质将有助于理解HDL颗粒中蛋白的不同功能。
二、 研究背景：（简要介绍研究进展动态、研究目的和意义）
HDL由于结构和组成的异质性与多种心脏保护功能相关。超过100种蛋白被鉴定属于HDL，其中2种最丰富的蛋白载脂蛋白A1（apolipoprotein，APOA1）和载脂蛋白2（apolipoprotein，APOA2）占HDL蛋白的90%。根据密度不同，HDL分为HDL3和HDL2两类。目前大多数的研究使用利用DDA来鉴定和定量HDL亚类。然而这种方法的随机性和高缺失值率阻碍了对低丰度蛋白的准确定量。而在三重四级杆质谱仪上的SRM模式和在Q-TOF、Qrbitrap质谱仪上的PRM模式的靶向检测可以克服DDA方法中的这些限制，具有高灵敏性、准确性和重现性，对复杂生物样品中的多个肽段同时进行定量监测，但这两种方法都必须有已知的母粒子。DIA作为一种新引入的质谱蛋白质组学方法，具有低缺失值率和良好的重现性。因而该研究比较了DIA和PRM在对不同HDL亚类蛋白的定量能力。
三、实验设计：
实验设计策略
四、研究成果：（重点图表展示）
1、DIA和PRM方法在HDL基质中的分析效果
将商品化iRT肽段溶液加入到HDL的基质中，稀释成在250倍范围内的 6个浓度，分别用PRM和DIA的方法进行检测，统计iRT中12条肽段在HDL基质中的回收率、精密度和LLOQ。通过比较肽段的理论浓度和设计检测浓度，两种检测方法均展现了良好的的回收率（表1）；每个样品上机3次，其中DIA检测的CV在0.9-6.5%，PRM检测的CV在1.2-6%，两种检测方法的CV均在20%以下，显示了良好的精密度（图2A）。对于iRT肽段检测的LLOQ，12条iRT肽段中67%，DIA和PRM具有一致的LLOQ；剩余33%的肽段，DIA比PRM具有更低的LLOQ值（图2B）。这与一般情况下DIA比PRM低3-10倍的敏感性不一致。
表1.通过DIA和PRM检测iRT肽段在HDL基质中的重现性、线形和回收率
图2.比较DIA和PRM对HDL基质中iRT肽段的分析效果。（A）DIA和PRM检测不同肽段的CV值分布的小提琴图；（B）比较DIA和PRM检测iRT肽段的LLOQ；
2、目标检测方法的建立QC样本中内标和外标的表现
根据以上12条iRT肽段在HDL基质中的检测结果，DIA和PRM具有相似的检测效果。随后评估了DIA和PRM在19个样本中定量HDL2和HDL3的能力，建立了一个包含38个蛋白和199条肽段的谱图库。其中DIA可以定量HDL中的30个蛋白和85个母离子，PRM可定量检测30个蛋白和91个母离子。根据肽段配对最佳的Pearson相关系数，选择了在HDL QC中CV最小的肽段，最终24个蛋白被选取作为检测目标。
在本研究中通过两种策略控制变量，一种是pool一个HDL QC并且在样本检测中穿插QC样本，根据QC的检测结果，在DIA和PRM两种检测方法下，大部分肽段的CV均在20%以下（图3A）；为了更好的展示QC数据的变异，根据积分面积将肽段分为四分位数，其中峰面积在75th四分位的CV值更低，DIA和PRM的检测CV的中位数分别为8.1%和7.0%，PRM在检测低丰度蛋白的显示更好的重现性（图3B）。另外比较QC和19个生物样本HDL2、HDL3在DIA和PRM方法的检测下的肽段CV，QC样本中检测肽段相对生物样本中具有更低的CV值（图3C）。另一种将一定浓度的血管紧张素肽段I作为内标加入到所有的生物样本中，在DIA和PRM检测方法中，内标的CV分别为20%和19.4%。
图3. DIA和PRM定量HDL亚类的重现性。（A）在pool HDL样本中所有蛋白的CV值分布；（B）积分面积底部和顶部四分位的CV分布；（C）比较QC样本和HDL2、HDL3生物样本中的CV分布；
3.DIA和PRM方法的一致性
该研究比较了各特异肽段在DIA和PRM检测方法下峰面积的一致性，在HDL2、HDL3亚类中，两种检测方法中相关性系数>0.9的肽段分别占在62%和92%（图4A）。 提取HDL中丰度较高的APOA2和丰度较低的APOL-1，在HDL2和HDL3样本中，两种检测方法的相关性系数均>0.9,（图4B、C、D、E）。另外通过Bland− Altman图也显示了APOA2和APOL-1在DIA和PRM的检测中具有良好的一致性（图5A）。因而，对于大多数检测的肽段，DIA和PRM的测量结果具有很好的一致性。
图4. DIA和PRM方法对HDL亚类肽段检测的相关性。（A）PRM和DIA定量分析HDL2和HDL3中肽段r>0.5的Pearson相关系数；通过测定HDL2（B）和HDL3（C）中APOA2肽段以及HDL2（D）和HDL3（E）的APOL-1肽段的积分面积，比较DIA和PRM方法的相关性。
图5. 19名健康人血浆中分离出的HDL2和HDL3中APOA2和APOL-1的Bland-Altman图；
4. DIA和PRM的方法可区分HDL2和HDL3亚类
当用DIA和PRM方法比较HDL2和HDL3亚类时，得到了几乎相同的结果，证实了两种方法可比的定量能力，且在HDL亚类共有的24个蛋白中，每种特定蛋白的量在2个亚类中有显著差异（图6）。
图6. DIA（A）和PRM（B）方法中19名健康人血浆中分离出的HDL2和HDL3蛋白的定量。
五、文章亮点（结论讨论）：
HDL是一类含有多种蛋白的复杂颗粒，临床测量其胆固醇含量并不能完全反映HDL的的异质性。之前的研究证明SRM和PRM在精确定量HDL上具有较为一致的效果。在该工作中，比较了DIA和PRM在HDL蛋白质组中定量分析能力。这两种方法在精密度、回收率和线形上具有极高的一致性。因此，DIA和PRM是准确定量HDL的有效方法。同时，该工作中DIA和PRM量化之间的显著一致性以及在区分HDL2和HDL3蛋白组方面显示出相似的能力。DIA是一种精确而可靠的量化策略。
阅读人：陈凌云