Near-optimal RNA-Seq quantification https://pachterlab.github.io/kallisto
输入输出文件说明：http://bio.math.berkeley.edu/eXpress/manual.html
文章标题：
Pseudoalignment for metagenomic read assignment
文章摘要：
We explore connections between metagenomic read assignment and the quantification of transcripts from RNA-Seq data. In particular, we show that the recent idea of pseudoalignment introduced in the RNA-Seq context is suitable in the metagenomics setting. When coupled with the Expectation-Maximization (EM) algorithm, reads can be assigned far more accurately and quickly than is currently possible with state of the art software.
源代码：
安装：
测试：
[[email protected] test]$ /project/metagenomics_benchmark/kallisto_linux-v0.43.0/kallisto index -i --index transcripts.fasta
[[email protected] test]$ /project/metagenomics_benchmark/kallisto_linux-v0.43.0/kallisto quant -i --index -o output reads_1.fastq reads_2.fastq（输入文件）
[[email protected] output]$ more abundance.tsv
target_id length eff_length est_counts tpm
NM_001168316 2283 2105.9 160.606 12581
NM_174914 2385 2207.9 1500.72 112128
NR_031764 1853 1675.9 102.671 10106.2
NM_004503 1681 1503.9 331.118 36320.7
NM_006897 1541 1363.9 664 80311.3
NM_014212 2037 1859.9 55 4878.25
NM_014620 2300 2122.9 591.166 45937.9
NM_017409 1959 1781.9 47 4351.17
NM_017410 2396 2218.9 42 3122.5
NM_018953 1612 1434.9 227.999 26212.1
NM_022658 2288 2110.9 4881 381446
NM_153633 1666 1488.9 361.044 40002.4
NM_153693 2072 1894.9 73.6719 6413.67
NM_173860 849 671.903 962 236189
NR_003084 1640 1462.9 0.00164208 0.18517
使用说明：
kallisto
kallisto是一个用高通量测序片段从ＲＮＡ序列或更为普遍的目标序列中量化转录丰富度的一个程序。它是基于伪对齐的新的数据，用于快速确定reads目标，而无需alignment。在标准的ＲＮＡ序列数据中，kallisto能够在mac系统上用不到十分钟的时间构建索引，用不到三分钟的时间量化（也就是分类）３千ｗ人类的reads。reads伪对齐保留关键信息需要量化，并且kallisto不仅速度快，而且比现有的量化工具准确。事实上，由于伪对齐的过程是对reads出错上的健壮性，在许多基准中kallisto显著优于现有的工具。
kallisto能够用sleuth量化RNA序列分析。
kallisto产生的使用选项，这是一个列表：
kallisto 0.43.0
Usage: kallisto <CMD> [arguments] ..
Where <CMD> can be one of:
index Builds a kallisto index #构建一个kallisto索引
quant Runs the quantification algorithm #运行量化分析算法
pseudo Runs the pseudoalignment step#运行为比对
h5dump Converts HDF5-formatted results to plaintext#格式转换
version Prints version information#输出版本信息
cite Prints citation information#引用信息
Running kallisto <CMD> without arguments prints usage information for <CMD>
关于这些command说明如下：
index ：
kallisto index建立从靶序列的FASTA格式的文件的索引。该指数命令的参数有：
kallisto 0.43.0
Builds a kallisto index
Usage: kallisto index [arguments] FASTA-files#输入文件
Required argument: #必选参数
-i, --index=STRING Filename for the kallisto index to be constructed #kallisto索引被构建的文件名
Optional argument:
-k, --kmer-size=INT k-mer (odd) length (default: 31, max value: 31)
--make-unique Replace repeated target names with unique names
输入文件为fasta格式，可以是压缩文件。
quant：
kallisto quant运行量化算法。对于定量命令的参数有：
kallisto 0.43.0
Computes equivalence classes for reads and quantifies abundances#对reads进行分类和物种丰富度评估
Usage: kallisto quant [arguments] FASTQ-files #输入文件
Required arguments: #必选参数
-i, --index=STRING Filename for the kallisto index to be used for
quantification #索引文件
-o, --output-dir=STRING Directory to write output to #输出文件目录
Optional arguments:
--bias Perform sequence based bias correction
-b, --bootstrap-samples=INT Number of bootstrap samples (default: 0)
--seed=INT Seed for the bootstrap sampling (default: 42)
--plaintext Output plaintext instead of HDF5
--single Quantify single-end reads
--fr-stranded Strand specific reads, first read forward
--rf-stranded Strand specific reads, first read reverse
-l, --fragment-length=DOUBLE Estimated average fragment length
-s, --sd=DOUBLE Estimated standard deviation of fragment length
(default: value is estimated from the input data)
-t, --threads=INT Number of threads to use (default: 1)
--pseudobam Output pseudoalignments in SAM format to stdout
kallisto可以处理单端或双端的序列，默认情况下是双端序列，输入为fastq文件：
kallisto quant -i index -o output pairA_1.fastq pairA_2.fastq pairB_1.fastq pairB_2.fastq
对于单端序列可以用 选项 --single ，也可用用 -l 和 -s 选项，然后列出输入的fastq文件即可：
kallisto quant -i index -o output --single -l 200 -s 20 file1.fastq.gz file2.fastq.gz file3.fastq.gzkallisto quant produces three output files by default:
kallisto定量分析默认产生三个输出文件：
- abundances.h5 ：二进制文件，包含运行信息，物种丰富度评估，bootstrap 评估等这个文件可以被sleuth打开阅读。
- abundances.tsv ：是一个物种丰富度的说明文件。
- run_info.json ：是一个包含运行的相关信息
可选参数说明：
Pseudobam：
--pseudobam，所有的伪比对输出格式为格式。可以被定向到一个文件中，也可以用samtools转换成bam。
例如： kallisto quant -i index -o out --pseudobam r1.fastq r2.fastq > out.sam
或者用samtools：
kallisto quant -i index -o out --pseudobam r1.fastq r2.fastq | samtools view -Sb - > out.bam（学校的秋天，哈哈）
pseudo
kallisto pseudo只是在伪比对这一环节运行并且其目的是为在单细胞RNA的序列的使用。pseudo详细的命令选项如下：
kallisto 0.43.0
Computes equivalence classes for reads and quantifies abundances
Usage: kallisto pseudo [arguments] FASTQ-files
Required arguments:
-i, --index=STRING Filename for the kallisto index to be used for
pseudoalignment
-o, --output-dir=STRING Directory to write output to
Optional arguments:
-u --umi First file in pair is a UMI file
-b --batch=FILE Process files listed in FILE
--single Quantify single-end reads
-l, --fragment-length=DOUBLE Estimated average fragment length
-s, --sd=DOUBLE Estimated standard deviation of fragment length
(default: value is estimated from the input data)
-t, --threads=INT Number of threads to use (default: 1)
--pseudobam Output pseudoalignments in SAM format to stdout该命令的格式和参数的含义是与quant命令相同。然而，pseudo不运行EM算法来量化丰度。此外pseudo指令有一个选项在批处理文件中指定许多细胞，如：
kallisto pseudo -i index -o output -b batch.txt h5dump
kallisto h5dump转换 hdf5格式。对于h5dump命令的参数有：
kallisto 0.43.0
Converts HDF5-formatted results to plaintext
Usage: kallisto h5dump [arguments] abundance.h5
Required argument:
-o, --output-dir=STRING Directory to write output to